Общие принципы организации эндоцитозного пути

Невзирая на существование заморочек идентификации компартментов эндоцитозного пути, бессчетные исследования позволили выявить некие закономерности (рис. 8).


Рис. 8. Общая черта эндоцитозного пути.
РЭ – ранешние эндосомы; ПЭ – поздние эндосомы

Во-1-х, эндоцитозный путь имеет векторную компанию – от мембраны к околоядерной области, – за счет того, что транспорт эндосом происходит по микротрубочкам, более нередко организованным в круговую Общие принципы организации эндоцитозного пути сеть с центром схождения в околоядерной области (им нередко является ЦОМТ, центр организации микротрубочек). Ранешние эндосомы размещаются в большей степени на периферии клеточки. Со временем грузы обнаруживаются в более больших эндосомах, которые находятся в околоядерной области, расположенной в конкретной близости от центра организации микротрубочек. Таким макаром, для возникновения груза в Общие принципы организации эндоцитозного пути поздних околоядерных эндосомах нужны микротрубочки. Предполагалось, что околоядерные эндосомы ― это уже поздние эндосомы и их локализация упрощает взаимодействие с лизосомами, также расположенными в большей степени около ядра, рядом с ЦОМТ.

Во-2-х, было подтверждено, что по ходу эндоцитозного пути происходит закисление внутреннего места эндосом за счет работы протонной Общие принципы организации эндоцитозного пути вакуолярной помпы, интегрированной в мембрану эндосом.

В третьих, исследования слияния эндосом в системах in vitro показало, что есть ограничения в слиянии эндосом вместе. Так, ранешние эндосомы способны соединяться с ранешними, а поздние ― с поздними, что гласит об общих свойствах их мембран (в данном случае мембраны именуется гомотипичными), тогда как Общие принципы организации эндоцитозного пути гетеротипические слияния (ранешних эндосом с поздними) фактически не происходят. Невозможность гетеротипических слияний отражает значительные различия в свойствах мембран ранешних и поздних эндосом.

2.2.4. Ранешние эндосомы ― основная сортирующая стадия эндоцитозного пути. Вероятные механизмы сортировки
на путь рециклирования и лизосомной деградации

Задачки, которые клеточка решает при помощи эндоцитоза, довольно широки. Так, пиноцитоз позволяет изменять Общие принципы организации эндоцитозного пути площадь поверхности мембраны, к примеру, при движении клеточки. Эндоцитоз метаболических рецепторов призван пичкать клеточку уже готовыми питательными субстанциями и строительным материалом, которые она не может синтезировать сама. К примеру, трансферрин (в комплексе с сенсором трансферрина) связывает ионы железа во внеклеточном пространстве, и при помощи РОЭ переносит Общие принципы организации эндоцитозного пути их в эндосомы, откуда они поступают в цитоплазму. Разумеется, что в данном случае направлять сенсоры на деградацию в лизосомы было бы очень расточительно. Вправду, большая часть комплексов лигандов и метаболических рецепторов после интернализации диссоциируют, при всем этом лиганды, обычно, направляются в лизосомы, а сенсоры рециклируют назад на поверхность, чтоб принять Общие принципы организации эндоцитозного пути роль в новых раундах эндоцитоза.

Многие молекулы, принимающие роль в проведении сигналов (к примеру, пептидные причины роста), реализуют свое действие на клеточку через специальные мембранные сенсоры, которые и являются настоящими «сигнальными молекулами». Различные классы таких лиганд-рецепторных комплексов также интернализуются, но в общем случае и лиганд, и сенсор может Общие принципы организации эндоцитозного пути ждать разная судьба. Так, оба, в отличие от метаболических рецепторов и их лигандов, могут доставляться в лизосомы. С одной стороны, это позволяет убрать «лишние» сенсоры с мембраны и тем уменьшить стимулируемый лигандом сигнал. С другой стороны, лиганд-рецепторные комплексы в эндосомах способны генерировать собственные сигналы. В определенных критериях сигнальные Общие принципы организации эндоцитозного пути лиганд-рецепторные комплексы могут рециклировать, а соотношение меж методом рециклирования и дергадации будет определять продолжительность и интенсивность генерируемых сигналов.

Различные молекулы-грузы, попадая в клеточку через разные порталы, оказываются в ранешних эндосомах, которые могут соединяться, что приводит к смешиванию грузов. Беря во внимание вышеупомянутое, основная задачка ранешних эндосом Общие принципы организации эндоцитозного пути – рассортировать грузы и навести каждый по подходящему пути. Таким макаром, если на биосинтетическом пути сортировка грузов происходит на выходе из АГ, то на эндоцитозном пути основной «сортирующей станцией» являются ранешние эндосомы. Практически, из ранешних эндосом берут начало разные пути, ведущие ко всем компартментам. Основными являются пути рециклирования на плазматическую мембрану Общие принципы организации эндоцитозного пути и путь лизосомной деградации. Через ранешние эндосомы идет трансцитозный путь. Вероятна также доставка грузов к транс-Гольджи и ЭПР.

Механизмы, обеспечивающие сортировку, издавна занимали мозги исследователей. Работы 80-х–90-х годов позволили сконструировать догадки, связывавшие сортировку с тубуловезикулярной морфологией ранешних эндосом и со сниженным уровнем эндосомного рН.

Вправду, было увидено, что разные Общие принципы организации эндоцитозного пути лиганд-рецепторные комплексы диссоциируют при достижении определенного уровня pH в эндосомах. Лиганды при всем этом перебегают в водянистую фазу люмена эндосомы, тогда как сенсоры остаются в мембране. Высказывались догадки, что разделение лигандов и рецепторов основано на соотношении объема к площади поверхности эндосомы. Вправду, если представить, что диссоциировавший лиганд умеренно Общие принципы организации эндоцитозного пути распределен в объеме эндосомы (в «жидкой фазе»), а сенсор ― в мембране, то везикулярная часть эндосомы будет содержать в большей степени лиганд (отношение площади поверхности к объему сравнимо не достаточно), а тубулярный отросток ― в большей степени сенсор (отношение площади поверхности к объему велико). Таким макаром, считали, что из тубулярных Общие принципы организации эндоцитозного пути частей эндосомы идет рециклирование, тогда как из везикулярной части идет перенос груза в поздние эндосомы и дальше в лизосомы. Как будет дискуссироваться в последующих главах, эти моменты вправду существенны для сортировки, но они носят вероятностный нрав, не позволяя избирательно включать в определенные везикулы молекулы только 1-го типа и Общие принципы организации эндоцитозного пути исключать другие. На данный момент уже стало разумеется, что специальные активные механизмы играют более значительную роль в процессе сортировки, позволяя не только лишь сегрегировать определенные грузы в различных доменах эндосомной мембраны, да и концентрировать их там. Все же, угнетение градиента рН повдоль эндоцитозного пути способно поменять внутриклеточную судьбу интернализованного груза Общие принципы организации эндоцитозного пути.

2.2.5. Трудности идентификации ранешних и поздних
эндосом. Современные представления об организации эндоцитозного пути. Роль мультивезикулярных эндосом и лизосом

Как уже упоминалось в главе, посвященной описанию главных эндоцитозных компартментов, исследователи с самого начала столкнулись с большенными трудностями в определении ряда главных вопросов организации эндоцитозного пути. Во-1-х, гетерогенная, в главном везикулярная морфология Общие принципы организации эндоцитозного пути эндосом, не позволяла точно найти границу меж ранешними и поздними эндосомами. Потому природа поздних эндосом была полностью непонятна и вызывала бессчетные споры. Было совсем непонятно, как груз

передается из ранешних эндосом в поздние, и почему доставка в поздние эндосомы нужна для следующей деградации груза в лизосомах. Много вопросов появлялось Общие принципы организации эндоцитозного пути в связи с ролью мультивезикулярных тел (МВТ), так как, с одной стороны, эти органеллы всегда наблюдались в клеточках, в каких был стимулирован путь лизосомной деградации, а с другой стороны, механизм формирования этих структур был неясен.

Значимая неопределенность привела к тому, что на основании фактически одной и той же совокупы данных Общие принципы организации эндоцитозного пути различными исследователями были предложены принципно разные догадки организации эндоцитозного пути (рис. 9)

Одна из главных гипотез (создателем ее являлся Г. Гриффитс) исходила из идеи о том, что эндоцитозный путь ничем не ужаснее экзоцитозного, и должен быть организован «симметрично». Это значит, что если на антероградном пути имеются два размеренных, «предсуществующих Общие принципы организации эндоцитозного пути» (по терминологии Гриффитса) компартмента – ЭПР и АГ, – сообщение меж которыми осуществляется при помощи везикул, то и ранешние и поздние эндосомы также должны быть размеренными, «предсуществующими», компарментами, взаимодействующими при помощи везикул-переносчиков. В согласовании с этим главным постулатом теория получила заглавие догадки «эндосомных везикул-переносчиков» (endosomal carrier vesicles, ECVs hypothesis). Невозможность гетеропипического Общие принципы организации эндоцитозного пути слияния

догадка созревания эндосом (Murphy): РЭ преобразуются в ПЭ за счет постепенного конфигурации состава мембран МВТ = ПЭ
догадка эндосомальных везикул-переносчиков (Griffiths): РЭ и ПЭ – предсуществующиекомпартменты, сообщающиеся при помощи везикулярных посредников (ECV) МВТ = ECV

ПМ

Рис. 9. Сопоставление представлений об организации
эндоцитозного пути исходя из убеждений догадки эндосомальных
везикул-переносчиков и Общие принципы организации эндоцитозного пути догадки созревания эндосом

в этом контексте рассматривалась в качестве доказательства кардинальных различий мембран ранешних и поздних эндосом как мембран различных компартентов.

Предполагалось, что первичные эндосомы, отпочковавшиеся от ПМ, содержащие как белки водянистой фазы, так и мембранные, дальше соединяются с сетью тубуловезикулярных ранешних, либо сортирующих, эндосом. Белки, отправляемые в Общие принципы организации эндоцитозного пути поздние эндосомы, концентрируются в тех везикулярных доменах эндосом, из которых дальше формируются везикулы-переносчики. На роль везикул-переносчиков в контексте этой догадки претендовали конкретно МВТ. Создатели считали, что по сути внутренние включения не разделены от наружной мембраны МВТ, а организованы складками этой мембраны наподобие митохондриальных крист. Предполагалось, что конкретно для Общие принципы организации эндоцитозного пути формирования ECV и их отщепления от РЭ требовалось понижение уровня рН. Дальше по микротрубочкам МВТ-ECV путешествовали в околоядерную область, где сливались с позднеэндосомальным компартментом, представленным, по воззрению создателей, однойобщей структурой.В этом контексте места лизосомам не оставалось, потому что создатели догадки предлагали рассматривать конкретно поздние эндосомы в качестве основного Общие принципы организации эндоцитозного пути деградационного компартментом клеточки. Вправду, во фракции изолированных поздних эндосом экспериментально находили активности ряда лизосомных ферментов, хотя во фракции лизосом эта активность была на порядок выше. Все же, в рамках описываемой догадки лизосомам отводилась незавидная роль депо запасных лизосомных ферментов и хранилищ различного неполностью переваренного материала.

Эта догадка содержала и другие Общие принципы организации эндоцитозного пути непонятные моменты. Так, к примеру, был должен существовать узенький просвет времени, в течение которого возможность слияний эндосом, изолированных до него и после него, падала бы скачкообразно, соответственный моменту отделения везикулы-переносчика от ранешней эндосомы. Но проводимые в то же время несколькими группами ученых опыты проявили, что жестких запретов на Общие принципы организации эндоцитозного пути слияние ранешних и поздних эндосом нет. Вправду, возможность слияния эндосом падает с повышением промежутка времени, после которого получали фракцию поздних эндосом, но эта возможность падает равномерно, так же как равномерно миниатюризируется возможность рециклирования.

Не считая того, было найдено, что при одновременном эндоцитозе различных грузов, направляемых на Общие принципы организации эндоцитозного пути рециклирование и на деградацию (к примеру, сенсоры трансферрина и сенсоры причин роста), оба груза выявлялись поначалу в одних и тех же периферических тубуло-везикулярных эндосомах, а со временем – в одних и тех же МВТ. Но рециклирующий груз всегда оставался на наружной мембране эндосом, тогда как груз, направляемый на деградацию, равномерно скапливался Общие принципы организации эндоцитозного пути во внутренних пузырьках мультивезикулярных тел. Более того, в изолированной фракции более томных и электронно-плотных структур, содержащих наибольший уровень лизосомных ферментов и обычно считающейся фракцией вторичных лизосом, выявлялись обычные МВТ, плотно забитые маленькими внутренними пузырьками. Конкретно эти структуры во огромном количестве и окружали центр организации микротрубочек, не оставляя места Общие принципы организации эндоцитозного пути для какого или другого большого мембранного компартмента.

Таким макаром, реально наблюдались ранешние периферические тубуло-везикулярные структуры с признаками исходной стадии формирования внутренних пузырьков (инвагинации мембраны эндосомы). Дальше эти эндосомы передвигались в околоядерную область, параллельно увеличивая количество внутренних пузырьков. В итоге формировались плотно упакованные МВЭ, образующие кластер в околоядерной области Общие принципы организации эндоцитозного пути. После чего во внеклеточной среде начинали появляться продукты расщепления белков-грузов.

Таковой сценарий развития событий, имеющий еще более крепкое экспериментальное обоснование (благодаря работам различных исследовательских групп, первой из которых была группа проф. Мэрфи), получил название«гипотезы созревания эндосом» и в текущее время является признанным.

Итак, можно считать, что Общие принципы организации эндоцитозного пути «с точки зрения груза» вступление его на путь деградации значит попадание в везикулярный домен ранешней эндосомы. Дальше все действия развиваются на одной той же мембране, характеристики которой равномерно меняются. Во-1-х, рециклирующие белки с их липидным окружением покидают эндосому, тогда как в ее мембрану встраиваются пузырьки, несущие материал из транс Общие принципы организации эндоцитозного пути-Гольджи. Эндосомы со временем передвигаются в околоядерную область и укрупняются за счет множественных гомотипичных слияний вместе. Значительно выделить, что хотя перевоплощение ранешних эндосом в поздние мультвезикулярные идет не мгновенно, этот процесс в главном локализован конкретно в околоядерной области. Это значит, что околоядерные эндосомы не являются априори поздними Общие принципы организации эндоцитозного пути, а формирование инвагинаций и дальше внутренних пузырьков в главном инициируется после прибытия эндосом в околоядерную область. Такое размещение значительно уменьшает и путь от TGN до эндосом.

Рециклирование идет в два шага: 1-ый может начинаться сразу после интернализации и t1/2 этой волны обычно от 2 до 10 мин, тогда как 2-ой «длинный» цикл связан с Общие принципы организации эндоцитозного пути путешествием рециклирующих грузов в околоядерную область и формированием рециклирующих эндосом конкретно там. Таким методом, к примеру, идет рециклирование сенсора трансферрина. Может быть, необходимость настолько длинноватого круга связана с тем, что высвобождение железа в случае трансферрина либо других лигандов в других случаях просит, как упоминалось выше, сниженного уровня Общие принципы организации эндоцитозного пути рН, и таковой уровень в эндосомах достигается только через 20–40 мин эндоцитоза. В этой связи нередко молвят о «позднем рециклирующем компартменте» с околоядерной локализацией, но с большей вероятностью этот «компартмент» высокодинамичен и его наличие либо отсутствие (т. е. присутствие скопления везикул, содержащих рециклирующие молекулы), находится в зависимости от скорости транспорта и количества Общие принципы организации эндоцитозного пути материала, который клеточке нужно возвратить на поверхность.

Итак, главные действия процесса созревания эндосом, приводящего к их превращению в поздние, происходят в околоядерной области. В предстоящем мы тщательно разглядим молекулярные нюансы созревания. Следует отметить, что процесс этот многостадийный, занимает довольно много времени (от 10-ов минут до нескольких часов) и идет несинхронно Общие принципы организации эндоцитозного пути, в итоге чего клеточка может содержать набор поздних эндосомах различной степени зрелости.

На заключительном шаге созревания мультивезикулярные поздние эндосомы, содержащие все созданные для деградации мембранные белки во внутренних пузырьках, становятся компетентными для взаимодействия с первичными лизосомами (это значит, что их мембрана приобретает характеристики, которые делают вероятным ее взаимодействие Общие принципы организации эндоцитозного пути с мембраной первичной лизосомы). Первичные лизосомы, обычно, представляют собой некрупные везикулы (около 100 нм), с нейтральным внутренним рН и высочайшей концентрацией лизосомных гидролаз. Беря во внимание, что рН-оптимум для большинства этих ферментов находится в кислой области, они активизируются только после слияния с поздними закисленными эндосомами.

В согласовании с принятой Общие принципы организации эндоцитозного пути в текущее время точкой зрения (рис. 10), взаимодействие эндосом с лизосомами сводится к образованию так именуемых гибридных эндо-лизосом, т. е. происходит по механизму временного слияния, именуемому “kiss-and-run”. За время существования гибридной органеллы мембраны 2-ух везикул перемешиваются, и активные гидролазы расщепляют белки и липиды, созданные для деградации Общие принципы организации эндоцитозного пути. Потом, наступает шаг сегрегации, в процессе которого лизосома «собирает» свои ферменты, структурные белки и мембраны и отсоединяется от бывшей поздней эндосомы, которая сейчас содержит продукты деградации (часть из их, к примеру, некие аминокислоты, могут покидать ее, конкретно проходя через мембрану в цитоплазму). Конкретно такие структуры, и остатки мембран Общие принципы организации эндоцитозного пути, обычно электронно-плотные при электронно-микроскопическом анализе и более томные при субклеточном фракционированиии, и именуются лизосомами, хотя терминологически более точно будет именовать их «вторичными лизосомами».

Рис. 10. Поздние этапы деградационного эндоцитозного пути:
а) – зрелые МВТ могут соединяться с плазматической
мембраной (к примеру в антиген-презентирующих клеточках);
б) – взаимодействие и предстоящая судьба зрелой Общие принципы организации эндоцитозного пути поздней
эндосомы после ее встречи с первичной лизосомой

Большая часть описаний деградационного эндоцитозного пути на этом заканчивается, хотя в реальности последней стадией эндоцитозного пути является перемещение вторичных лизосом по микротрубочкам к плазматической мембране и слияние с ней (может быть, неполное). В итоге продукты деградации и внутренние пузырьки секретируются Общие принципы организации эндоцитозного пути в окружающую среду. Любопытно, что не только лишь лизосомы, да и мультивезикулярные тела могут соединяться с плазматической мембраной, и эта способность употребляется в процессе презентации антигенов, так как внутренние пузырьки (именуемые в данном случае экзосомами) содержат экспонированные на их поверхности куски антигенов, получившихся в итоге частичной деградации. Таким макаром, эндоцитозный путь, начинаясь Общие принципы организации эндоцитозного пути на плазматической мембране, на ней же и заканчивается.

Существует очередной процесс большой физиологической значимости, связаный с эндосомами ― это процесс аутофагии. Как понятно, в неблагоприятных критериях (голодание, стресс) либо при изменении редокс-статуса клеточка может вступить на путь экономии энергозатрат, запустив механизмы, в итоге работы которых часть цитоплазмы с Общие принципы организации эндоцитозного пути содержащимися в ней органеллами (митохондриями, пероксисомами и др.) оказывается окруженным двойным слоем мембран – аутофагосомой. Уже из наименования следует, что конечной судьбой содержимого аутофагосомы является его деградация после слияния с лизосомами. Относительно происхождения мембран аутофагосом окончательного представления еще не сформировалось, но высока возможность того, что ранешние эндосомы принимают Общие принципы организации эндоцитозного пути самое активное роль в формировании аутофагосомы. Имеющиеся в данный момент данные о появлении аутофагосом и регуляции этого процесса подвергнутся рассмотрению в следующих частях пособия.

3. ФОРМИРОВАНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ ПУЗЫРЬКОВ

3.1. ОКАЙМЛЕНИЯ И ИХ ТИПЫ

Как упоминалось выше, формирование транспортного пузырька связано с появлением «почки», либо инвагинации мембраны, направленной из люмена органеллы в цитоплазму. На этой Общие принципы организации эндоцитозного пути стадии главную роль играют так именуемые белки окаймлений, обеспечивающие специфика места и времени появления транспортной везикулы и селекцию определенного груза.

В текущее время выделяют несколько типов окаймлений: COPI и COPII (заглавие происходит от слов coat proteins, либо белки окаймления) и несколько типов так именуемых «клатриновых окаймлений». К последним относятся Общие принципы организации эндоцитозного пути гетеротетрамерные AP (adaptor proteins) окаймления АР1, АР2, АР3 и АР4, мономерные АР180 и GGA1-3. Клатриновыми эти окаймления окрестили поэтому, что общим для всех их компонентом является гексамерный белок клатрин, кроме АР3-окаймления, работающего без клатрина. Необходимо подчеркнуть, что кажущееся обилие по сути не так велико, так как некие (в главном большие Общие принципы организации эндоцитозного пути) субъединицы всех окаймлений (и СОР, и «клатриновых) владеют значимой степенью гомологии и, может быть, произошли от 1-го общего предшественника. Дальше, в процессе эволюции адаптивные механизмы уже привели к бессчетным «вариациям на тему», обеспечивающим огромную специфика как по отношению к определенным транспортным путям, так и по отношению к Общие принципы организации эндоцитозного пути грузам. Участки транспортных путей, на которых работают те либо другие окаймления, представлены на рис. 11. Из схемы видно, что COP-окаймления обслуживают в главном прямой и оборотный транспорт по биосинтетическому пути, тогда как клатриновые окаймления участвуют в формировании везикул в процессе эндо- и экзоцитоза.

Рис. 11. Участки транспортных путей, обслуживаемые Общие принципы организации эндоцитозного пути
окаймлениями различных типов

Не исключена возможность того, что есть и неведомые пока окаймления, так как не для всех транспортных путей они определены (к примеру, непонятно, какое окаймление участвует в формировании пиноцитозных пузырьков).

3.2. СОРI ОКАЙМЛЕНИЕ

По имеющимся в текущее время представлениям, СОРI обслуживает транспорт меж цистернами аппарата Гольджи (так именуемый интра-Гольджи транспорт, intraGolgi traffic Общие принципы организации эндоцитозного пути) и возврат резидентных белков ЭПР назад из цис- цистерны в ЭПР.

Пробы реконструкции формирования COPI-окаймлений в системе in vitro , проявили, что для образования COPI-окаймленных пузырьков нужны три компонента (так именуемая «минимальная система»): липосома, содержащая кислые липиды (1), мультимерный белковый комплекс «коутомер» (coatomer) (2) и малая ГТФаза семейства Arf Общие принципы организации эндоцитозного пути, Arf1, нареченная инициирующей по ее роли в формировании окаймления.


Рис.12. Субъединичная организация
СОРI- окаймления

Коутомер состоит из субъединиц различного размера (от 20 до 160 кДа) и существует в цитоплазме ввиде комплекса, не диссоциируя. По всей видимости, состав коутомера может разнообразить благодаря наличию изоформ неких субъединиц.

Малая ГТФаза Arf1 заякоривается в мембране Общие принципы организации эндоцитозного пути благодаря наличию остатка миристиловой кислоты. В ГДФ-связанном состоянии Arf1 неактивна и локализована в цитозоле. Ее конформация в данном случае позволяет образовать кармашек, экранирующий гидрофобный миристиловый хвост от гидрофильного окружения цитоплазмы. Ассоциация с мембраной растворимого GEF для Arf1 приводит к ее связыванию с GEF и подменой ГДФ на ГТФ, т Общие принципы организации эндоцитозного пути. е. к активации малой ГТФазы (рис. 13). На природных мембранах АГ активная Arf1 рекрутирует фермент липидного обмена фосфолипазу D (PLD), которая расщепляет фосфатидилхолин цитоплазматического слоя мембраны АГ на холин и фосфатидную кислоту, несущую отрицательный заряд. Подразумевают, что образование мембранных доменов, обогащенных этим липидом, приводит к повышению расстояния меж молекулами наружного Общие принципы организации эндоцитозного пути слоя и, таким макаром, инициирует изначальное искривление мембраны в месте локализации комплекса GEF-Arf1-ГТФ и PLD.

Рис. 13. Сборка COPI-окаймления

На последующем шаге параллельно происходит несколько процессов. Во-1-х, активный Arf1 начинает рекрутировать (завлекать) из цитоплазмы коутомеры к месту образования пузырька, что в итоге приводит к формированию сполошного Общие принципы организации эндоцитозного пути окаймления; во-2-х, идет процесс заполнения везикулы и регуляторными компонентами, отвечающими за правильную доставку и слияние с мембраной-мишенью, и молекулами-грузами. Грузами для COPI–везикул являются в главном резидентные белки ЭПР, владеющие сигнальными последовательностями KKXX и KDEL. В мембране ЭПР и цис-АГ есть сенсоры, узнающие белки с этими последовательностями Общие принципы организации эндоцитозного пути (ERD-рецепторы), а субъединицы коутомера и регуляторных белков также имеют домены, способные связываться как с рецепторми, так и их грузом.

После окончания формирования пузырька, когда коутомеры образуют сплошное покрытие, а мембрана везикулы искривляется так, что формируется пузырек, связанный с мембраной ЭПР только через узкую «шейку», активизируется GAP Общие принципы организации эндоцитозного пути для Arf1, происходит гидролиз ГТФ, везикула отшнуровывается от мембраны-донора и начинает терять свое окаймление, так как Arf1 перебегает в неактивное состояние.

Таким макаром, весь процесс инициируется связыванием с мембраной Arf1-ГТФ, искривление мембраны происходит как за счет модификации липидов, так и за счет сил, развивающихся при кластеризации коутомеров, а Общие принципы организации эндоцитозного пути гидролиз ГТФ, приводящий к разборке окаймления и возникновению готового к транспортировке пузырька с грузом, должен происходить на самой последней стадии.

Но оказалось, что динамика гидролиза ГТФ имеет очень непростой нрав. Вправду, если исходить из предложенной схемы, то добавление в систему in vitro негидролизуемого аналога ГТФ, ГТФ-γS Общие принципы организации эндоцитозного пути, должно содействовать скоплению неотшнурованных окаймленных пузырьков. На самом деле же выяснилось, что невозможность гидролиза ГТФ перекрывает процесс на еще более ранешней стадии, а конкретно, подавляет скопление груза. В текущее время молвят о существовании 2-ух GAP-активностей. Циклы гидролиза ГТФ на Arf1 под действием «медленной» ГТФазы нужны для скопления груза Общие принципы организации эндоцитозного пути; она делает временное окно, в течение которого пузырек заполняется грузом.

«Быстрая» GAP-активность работает один раз на завершающем шаге – после полной сборки окаймления следует резвый гидролиз ГТФ на Arf1, отделение пузырька и разборка окаймления. Любопытно, что коутомер не является ArfGAP, все же, его ассоциация с везикулой существенно ускоряет гидролиз ГТФ Общие принципы организации эндоцитозного пути.

COPI обнаруживают не только лишь на мембранах АГ, но также и на эндосомах. Но в составе коутомера отсутствуют гамма- и бета-субъединицы; бета-COP посттрансляционно изменен (может быть, фосфорилирован); при всем этом COPI на эндосомах не много по сопоставлению с мембранами АГ. Роль этих СОРI-комплексов не полностью Общие принципы организации эндоцитозного пути ясна, но понятно, что недостатки по эпсилон-COP препятствуют образованию мультивезикулярных тел (!), а ассоциация с мембраной находится в зависимости от Rab-белков, а не Arf1. Все это позволяет полагать, что элементы COPI на эндосомах работают не как окаймления, а быстрее как сортирующая платформа, значимая для формирования поздних эндосом.

3.3. COPII-ОКАЙМЛЕНИЕ

COPII-окаймление обслуживает Общие принципы организации эндоцитозного пути исходный участок биосинтетического пути, участвуя в формировании транспортных пузырьков в «сайтах выхода» (exit sites) на мембранах ЭПР, несущих вновь синтезированные белки от ЭПР к цис-Гольджи (точнее, к тубуло-везикулярному кластеру цис-Гольджи). Это окаймление формируется по тому же принципу, что и COPII: процесс начинает инициирующая ГТФаза Общие принципы организации эндоцитозного пути, которая потом рекрутирует белковые комплексы окаймления. Но в деталях существует много различий. Так, малая, инициирующая ГТФаза, которой в данной случае является Sar1p, переводится в активное состояние при помощи GEF Sec12, который повсевременно локализован в мембране ЭПР. Дальше, хотя в малой системе для формирования COPII-окаймленных везикул липосомы должны содержать Общие принципы организации эндоцитозного пути кислые липиды во наружном слое, данных об участии ферментов липидного обмена в данном случае нет. В-3-х, белковые комплексы окаймления организованы труднее: имеются димеры белков Sec23/Sec24, которые рекрутируются к формирующейся везикуле активированным Sar1p. Эти димеры имеют веб-сайт связывания как с регуляторными элементами (SNARE), так Общие принципы организации эндоцитозного пути и с мембранно-связанными грузами либо сенсорами растворимых грузов. Дальше, к окаймлению присоединяются димер Sec13/Sec31 и белок скэффолда Sec16, способный создавать кластеры из нескольких разных димеров. Сборка этих комплексов приводит к конформационному изменению, нареченному полимеризацией (этот термин обширно применяется в литературе, хотя никаких ковалентных связей меж различными димерами не появляется). Присоединение Общие принципы организации эндоцитозного пути других участников окаймления активирует GAP для Sar1p, коим является Sec24. В итоге происходит искривление поверхности инвагинации, достаточное для формирования везикулы, и гидролиз ГТФ на Sar1p, что приводит к отшнуровыванию пузырька и разборке окаймления. Возможность того, что в данном случае, как и для COPI, есть неспешные Общие принципы организации эндоцитозного пути и резвые циклы гидролиза ГТФ, не исключена, но не подтверждена.

Биосинтетический путь только важен для клеточки, и составляющие транспортной машинерии, работающие тут, очень консервативны от дрожжей до млекопитающих. Терминология, приведенная выше, была введена в работах на дрожжевых системах, и хотя для млекопитающих почаще употребляют наименования «р13/p31», «p23/p24» и Общие принципы организации эндоцитозного пути т. д., наименования «p» и «Sec» равноупотребимы.

3.4. КЛАТРИНОВЫЕ ОКАЙМЛЕНИЯ. СТРОЕНИЕ АДАПТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ
СЕМЕЙСТВА АР И GGA. КЛАТРИН

Субъединицы комплексов именуются адаптинами и обозначаются по степени гомологии и в порядке убывания дескать. массы β1-β4 (big, 100 кДа), μ1-4 (medium, ок. 50 кДа), ϭ (small, 15–20 кДа). Четвертые субъединицы комплексов (160 кДа) относительно наименее гомологичны, и нередко именуются Общие принципы организации эндоцитозного пути вариабельными, потому они удостоились личных буквенных наименований: γ (АР1), α (AP2), δ (АР3), ε (АР4). Две самые большие субъединицы каждого комплекса организованы осесимметрично: их СООН-домены образуют глобулу (year), связанную с NH2-концевым глобулярным доменом (head) достаточно агрессивно организованным линейным мостиком (hindge). Малая и средняя субъединицы связаны с «головной» областью 2-ух огромных Общие принципы организации эндоцитозного пути субъединиц и вместе. Таким макаром, АР-комплекс имеет соответствующий вид «головы с ушами» (Рис. 14). Ухо β1-4 субъединиц отвечают за связывание с клатрином, голова вариабельных и μ1-4 субъединицы определяют связывание с грузом, тогда как ϭ1-4 определяют локализацию окаймления. Очень важную роль играет «ухо» вариабельной субъединицы, так как конкретно там находятся последовательности, с которыми ведут взаимодействие Общие принципы организации эндоцитозного пути регуляторные белки, определяющие последовательность формирования окаймления.


Рис. 14. Строение гетеромерных адапторных
комплексов АР1-4

Мономерные адапторные белки семейства GGA (Golgi-localized adaptor, γ-ear containing, ARF1- binding protein) 1, 2, 3 практически представляют собой изоформы γ-субъединицы АР1 комплекса.

Мономерный АР180 играет важную роль в формировании клатринового окаймления на плазматической мембране и посреди всех адаптинов обладает Общие принципы организации эндоцитозного пути большим сродством к клатрину.

Клатрин представляет собой гексамер соответствующей формы, содержащий три легкие и три томные цепи, попарно образующие узел (hub) своими С-терминальными доменами (рис. 15). Эта структура получила заглавие трискелион. Трискелионы при определенных критериях (рН 6.7, Mg2+) владеют способностью к самосборке, образуя плоские решетки, состоящие из гексагонов.

Рис. 15. Строение клатринового Общие принципы организации эндоцитозного пути трискелиона (слева) и
образованная из трискелионов плоская решетка (справа)

В присутствии липосом маленького поперечника (80–100 нм) трискелионы собираются в ажурную «корзиночку», на сто процентов покрывая липосому. При всем этом происходит перестройка, механизм которой неизвестен, но в итоге часть гексагонов заменяется на пентагоны, что позволяет сделать упорядоченную круглую структуру Общие принципы организации эндоцитозного пути. В нативных критериях формирование клатринового окаймления начинается на плоском участке мембраны, а реорганизации клатриновой сети является движущей силой искривления липидного бислоя.

Плоские клатриновые решетки достаточно впечатляющих размеров (несколько мкм2) выявлены на ранешних эндосомах, где их уникальные характеристики употребляются для селекции и концентрирования в ограниченных клатрином областях определенных мембранных белков Общие принципы организации эндоцитозного пути.


obshie-pravila-kachestvennogo-provedeniya-issledovanij.html
obshie-pravila-oformleniya-chertezhej.html
obshie-pravila-oformleniya-kursovih-rabot.html